含肝细胞生长因子水凝胶修复家兔股骨颈部缺损

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.52.019

摘要/Abstract

摘要：

背景：肝细胞生长因子可促进骨组织再生，在骨组织修复方面有着巨大的潜力，但是在体内较短的半衰期限制了其在临床的应用。

目的：观察含有肝细胞生长因子的半合成细胞外基质样水凝胶体内促进股骨颈骨缺损修复的作用。

方法：取12只兔制作双侧股骨颈骨缺损模型，采用自体配对对比，左侧为对照侧不对骨缺损做任何处置，右侧为实验侧植入含有肝细胞生长因子的半合成细胞外基质样水凝胶。

结果与结论：苏木精-伊红染色见2周时实验侧缺损修复区血管分布较对照侧均匀；4周时实验侧缺损区均匀填充新生骨小梁，而对照侧由外向内骨小梁形成减少；8周时实验侧缺损区皮质骨形成，并且骨髓腔再通，有骨髓细胞填充，对照侧仍有粗大骨痂填充缺损区，堵塞髓腔。钼靶X射线观测到8周时，实验侧难以区分正常骨质与新生骨质交界线，而对照侧缺损区与周围骨质分界明显。证实含有肝细胞生长因子的半合成细胞外基质样水凝胶可以促进家兔股骨颈部骨缺损的骨组织修复。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

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关键词: 组织构建, 缓释材料, 肝细胞生长因子, 细胞外基质材料, 组织工程, 水凝胶, 骨缺损, 修复, 兔, 半合成细胞外基质样水凝胶

Abstract:

BACKGROUND: Hepatocyte growth factor can promote bone regeneration and has a great potential in bone repair, but its shorter half-life in vivo limits its clinical application.

OBJECTIVE: To observe the promoting effect of semisynthetic extracellular matrix-like hydrogel containing hepatocyte growth factor on the repair of femoral neck defects in vivo.

METHODS: Twelve rabbits were taken to make bilateral femoral neck defect models. Based on autologous paired comparison, the left side was control side without treatment, and the right side served as experimental side undergoing implantation of semisynthetic extracellular matrix-like hydrogel containing hepatocyte growth factor.

RESULTS AND CONCLUSION: Hematoxylin-eosin staining showed more uniform distribution of vessels in the defect area of the experimental side than the control side after 2 weeks; after 4 weeks, new bone trabeculae were full of the defect area of the experimental side, but bone trabeculae from inside to outside formed less in the control side; after 8 weeks, cortical bone formation appeared in the experimental side, with the reascularization of the bone marrow cavity that was filled with the bone marrow cells, while in the controlled side, thick calluses were still full of the defect area which blocking the bone marrow cavity. Mammography X-ray observations showed that at 8 weeks, it was difficult to distinguish the border between normal bone and new bone in the experimental side, but the border was still obvious in the controls side. It is confirmed that semisynthetic extracellular matrix-like hydrogel containing hepatocyte growth factor is beneficial to repairing femoral neck defects of rabbits.

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Key words: hepatocyte growth factor, hydrogel, femur neck, drug carriers, models, animal

中图分类号:

R318

郭林，甄瑞鑫，赵德伟，田丰德，于晶，朱瑞萍. 含肝细胞生长因子水凝胶修复家兔股骨颈部缺损[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(52): 8470-8473.

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图/表（结果） 3

2.1 实验动物数量分析及一般观察结果 术后当天，家兔双耳下垂，精神不振，活动减少，饮食不佳，1周后精神、饮食、活动逐渐恢复如常。所有家兔切口无红肿，渗液，皮缘对合良好。2周左右时切口愈合，4周时缝线全部自然脱落，家兔毛发光泽，柔顺，双耳直立，夜间活动频繁，饮食良好。术后家兔无意外死亡，12只全部进入结果分析。

2.2 大体观察结果 取材时依原入路依次切开皮肤、皮下、肌肉、关节囊，均未见炎性病变。2，4周家兔股骨颈剖开后缺损处填充大量纤维及纤维骨枷，大体观察未见差别；8周后家对照侧有大量的骨枷充满髓腔，大头针刺入有阻力；实验侧可见重建的皮质骨及髓腔，但缺损区重建的皮质骨较周围正常皮质骨略薄，大头针难以刺入，缺损外侧填充少量纤维组织。见图1。

2.3 组织学苏木精-伊红观察结果

术后2周：实验侧缺损区域内大量纤维组织包绕于sECM多孔状结构周围，纤维组织中含有丰富的新生血管，缺损基底部可见间充质细胞增生，见图2A蓝色结构；对照侧缺损部填充大量纤维组织，纤维组织周围尚可见少量新生血管，中心部罕见血管样结构，缺损基底部亦可见间充质细胞增生。

术后4周：实验侧缺损区域内可见少量未吸收sECM空隙状结构，并且sECM边缘与周围组织紧密结合，见图2B蓝色结构，sECM周围纤维组织中较均匀的出现类骨质，类骨质边缘均可见血管结构；对照侧可见纤维组织周围即缺损基底部开始出现类骨质，随着血管结构的减少，类骨质由纤维组织边缘向中心逐渐减少。

术后8周：实验侧sECM消失，股骨颈缺损区域可见骨髓腔再通，缺损部由与周围缺损断端平滑延续的新生皮质骨封闭，新生皮质骨较周围正常皮质骨薄，但新生皮质骨中成骨细胞肥大，处于功能状态，见图3。

对照侧缺损断端凹陷延续为宽厚的骨枷，未见新生皮质骨结构，骨枷中成骨细胞功能活跃，骨髓腔闭塞，见图4。

2.4 放射学观察术后4周实验侧(右侧)较对照侧(左侧)均可见股骨颈部透亮区，右侧未观察到缺损边缘的明显变化，左侧可见缺边缘相对高密度；术后8周右侧骨缺损区域与周围骨质逐渐延续，难以区分正常骨质与新生骨质交界线。左侧缺损边缘骨质密度升高，缺损区与周围骨质分界明显。见图5。

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引言

材料方法

设计：左右侧自体配对对比，动物体内实验。

材料：

实验动物及分组：新西兰大白兔12只，兔龄6-8个月，雌雄不限，体质量2.5-3.3 kg，由大连大学实验动物中心提供。采用左右侧自体配对对比，左侧为对照侧，右侧为实验侧。

主要试剂：人重组肝细胞生长因子(PeproTech Asia Inc)；sECM(HyStem-C，Sigma-Aldrich Inc.)。

方法：

制备含肝细胞生长因子sECM：无菌条件下，按产品说明书分别溶解硫醇修饰的透明质酸(a)与硫醇修饰的明胶(b)，将a，b溶液混合，摇匀。按Zhao等^[7]报道，1 mL混合液加2.5 μg肝细胞生长因子，最后加聚二丙烯酸脂溶液，摇匀后分装到无菌EP管中，每管0.1 mL，室温放置30 min，待其交联成凝胶状，放入-20 ℃冻存备用。

股骨颈骨缺损模型制备：实验兔用3%戊巴比妥钠 (30 mg/kg)耳缘静脉注射麻醉，左侧卧位，取右髋关节后外侧切口，依次切开皮肤、皮下、股四头肌与臀大肌间筋膜，舌形切开臀中肌后部，牵开臀小肌，显露髋关节囊后部，十字切开髋关节囊，显露股骨颈后部，以3.5 mm钻头自股骨颈后部中心点钻入至前侧股骨颈皮质，不钻透前侧股骨颈皮质，再以4 mm钻头扩孔，造成直径4 mm股骨颈骨缺损，再用小刮匙刮除缺损部内外两侧髓腔内松质骨，在股骨颈部形成一个向后开口的窦道形骨缺损，植入相应材料，缝合关节囊，逐层缝合肌肉、筋膜、皮肤。左侧模型制作步骤同前，但不对缺损区做任何处理即缝合关节囊。术后家兔连续3 d肌注庆大霉素4×10⁴ U/只，分笼饲养，喂食普通饲料，随意活动。

主要观察指标：①一般情况观察：术后每天观察动物的活动、精神、饮食。观察手术部位有无皮肤红肿、感染、渗液以及脓肿。②标本大体观察：分别于术后2，4，8周时每组家兔处死4只取标本，依原手术入路，逐层切开，取材时详细观察缺损区周围组织有无炎症反应，缺损中部剖开，观察缺周围软组织与骨缺损修复情况。③组织学检查：取保留股骨头的股骨颈标本，体积分数4%甲醛固定10 h，5%硝酸脱钙完成后，自来水冲洗过夜，入自动脱水机脱水，石蜡包埋，修整标本至接近骨缺损矢状面中部间隔50 μm切片切3片，切片行苏木精-伊红染色。④放射学观察：分别于术后当天及术后4，8周拍摄钼靶双髋正位片，分别由两位10年工作经验以上放射科医师随即双盲评估，骨缺损修复情况。

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讨论

股骨颈包裹在关节囊内，股骨颈及股骨头部的血供大部分由旋股内、外侧动脉分支于股骨颈基底部吻合形成动脉环，在发出分支贴附于股骨颈表面上行至股骨头，营养股骨颈及股骨头。骨髓滋养动脉亦由骨髓腔向股骨头方向供应。小凹动脉只供应股骨头极少部分血供。所以，股骨头部的血供可以看成是由股骨颈基底部向股骨头部单向供应。基于股骨颈的特殊部位及特殊血供，作者制作股骨颈部缺损模型，避免周围软组织中血供对骨组织血供的影响。实验通过将含有肝细胞生长因子的sECM植入股骨颈缺损内，采用自体配对对比的方法，不同时间段提取标本，通过苏木精-伊红染色观察骨组织再生的情况，并与钼钯照相相结合，观测骨缺损的修复状况。

实验中观察到，2周时苏木精-伊红染色实验侧与对照侧无明显区别，均可见纤维组织增生；4周时实验侧观察到缺损区纤维组织内均匀生成的类骨质，血供丰富；血供是骨组织再生的基本条件，实验侧缺损区内纤维组织丰富的血供为骨组织的再生提供了充足的原料，均匀的血供使营养物质可以充分分布于修复区内，从而出现了全部缺损区内纤维组织近乎同步的向骨组织衍化，而对照侧纤维组织内随血供由外向内减少，新生类骨质也由外向内递减，在缺损中心部只见到纤维组织，而没有类骨质的出现。这种现象也在4周时的钼钯照相中得到体现，实验侧缺损区内出现了相对较弱的高密度影，而对照侧却出现了缺损中心部相对的低密度影。8周时苏木精-伊红染色实验侧骨髓腔内填充骨髓细胞和较多的脂肪细胞，骨缺损口由新生的皮质骨沿应力线方向生长，骨细胞肥大；而在同一时间段的对照组，苏木精-伊红染色见到粗大的骨痂结构，骨小梁排列紊乱，外部附着少量的纤维组织，但仍表现为一个凹陷的缺损状。钼钯照相中同样可以观察到8周时实验侧正常皮质区向缺损区延续，骨缺损区域分界线模糊；而对照侧出现了缺损边缘的高密度影。骨的再生与重建是同时进行的，应力线上的结构不断加强，而非应力区不断的吸收组成了骨组织的修复过程，在全股骨头的苏木精-伊红染色片中也可以看到实验侧8周时缺损部几乎恢复复至正常形态。

上述结果表明，含肝细胞生长因子的sECM明显促进股骨颈部骨组织的修复。这次实验结果支持Matsubara等^[8]与宫恩年等^[9]通过肝细胞生长因子基因转染的方法，使肝细胞生长因子在骨损伤区持续表达释放，促进骨组织再生的结论。

肝细胞生长因子促进骨组织再生的作用机制可能有：①促进血管再生，保证骨再生部位的血供。②加速成骨细胞成骨同时提高破骨细胞的功能，从而促进骨重塑^[10]。③上调骨损伤部位骨形态发生蛋白受体的表达，进而促进骨组织再生等。这次实验样本较少，未能完全证明上述机制，但其明显的促进骨组织修复的作用，预示着含有肝细胞生长因子的sECM作为一种新型的药物传输系统在骨组织的再生方面有着很好的应用前景。

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